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Introdução. O câncer de mama é um tema de importância mundial, com tratamentos convencionais muitas vezes ineficazes e efeitos colaterais significativos. A Terapia Fotodinâmica (TFD) associada à nanotecnologia é uma terapia que se destaca por sua baixa toxicidade cumulativa em subtipos agressivos de câncer. Neste contexto, a cultura celular tridimensional (3D) é uma alternativa promissora aos modelos animais, estabelecendo um microambiente heterogêneo, que mimetiza de maneira mais precisa os mecanismos celulares das neoplasias. Objetivo. Neste trabalho, a citotoxicidade de nanopartículas de ouro funcionalizadas com Clorina e6 (nanossondas) associados a TFD foi avaliada em cultura 3D. Metodologia. A cultura 3D foi realizada com a linhagem celular de adenocarcinoma mamário MDA-MB-468, cultivada com meio Leibovitz L-15 com 10% de soro fetal bovino, mantidos em incubadora com 95% de umidade e livre de CO₂. A técnica de micromoldes de agarose foi aplicada nas concentrações de 1,5% e 2%, e densidade inicial de 10⁴ células por estruturas. Os esferoides foram formados ao longo de 40 dias e caracterizados por lâminas histológicas coradas com hematoxilina e eosina (HE), os grupos experimentais foram subdivididos em amostras não tratadas (controle) e amostras submetidas TFD associadas as nanossondas à concentração de 2 μg/mL. Resultados. A análise do material evidenciou diferenças perceptíveis entre os grupos experimentais, os esferoides tratados apresentaram tumefação, núcleos picnóticos e citoplasma eosinofílico, sinais característicos de necrose celular. Conclusão. Estes achados apresentaram resultados coerentes aos estudos in vivo publicados na literatura.